王风平
上海交通大学生命科学技术学院

    深部生物圈是大洋钻探近年来最为重大的发现之一，逐渐成为全球生物学家和地球科学家关注的一个科学前沿和研究热点。虽然通过全世界科学家不懈的努力，目前科技界普遍认识到洋底下有一个巨大的深部生物圈的存在，并且推测在海洋沉积物中的微生物数量是全球生物总量的1/10-1/3,埋藏了56-200pg的碳，相当于地球上所有植物碳的总合。然而这个推测的数据来源基本上是有机质丰富的大陆架沉积物的调查，对广阔的有机质贫瘠的寡营养开阔大洋目前尚缺乏数据。并且，对面积更为庞大的岩石圈中的微生物数量和种类的认识更是缺乏。正是基于上述认识，IODP336计划通过对大西洋西侧翼的“北池区”的调查，关注低温脊侧翼岩石和沉积物中的微生物群体和它们的地质化学功能。

    IODP336航次的主要科学目标：1）. 建立海底观测站，安装CORK装置，通过原位实验研究低温脊侧翼发生的生物、化学和水文进程间的相互影响；2）. 采集完整的、无污染的岩石样品用于微生物学和分子学研究，调查该年轻低温洋脊侧翼岩石环境中微生物的丰度和种类，以及与环境参数，地热循环等的关系。3）. 采集海底沉积物，分析它们的生物组成并与其他航次开阔海洋站位和下层岩石样品进行比较，探索沉积物中微生物的来源问题，同时回答一些基本的科学问题：深部一些微生物群落的普遍分布性；可能的地球化学进程与特殊微生物类群的制约关系；深部脊侧翼的地热循环是否可以分散和交换热液喷口和低温沉积物中的原核生物。

    1. 航次背景介绍：

    IODP336钻探航次，调查地区为大西洋中脊（MAR）22°N西侧地带的北池（North Pond），主要研究该区一个孤立的沉积物池（最深约300米）及下覆基底的微生物群落。该位点属于慢速扩张洋脊，脊侧翼具有低温热流、年轻（7Ma）的特性。该区先前已被钻探（DSDP395站位），孔395A最后一次被ODP174B航次记入航海日志。北池作为理想研究对象，缘于其三个独特的特征：（1）以往对北池的研究已经提供了很多地球化学、水文和地质背景的相关信息；（2）年轻脊侧翼洋壳的研究和海底下“观测站”的建立，将会帮助确定年轻脊侧翼系统微生物群落的性质及其可能的在洋壳蚀变中的作用；（3）沉积池的封闭特性能够让我们回答深部固着群落的来源问题：微生物来自其本身所处的沉积物，亦或伴随着氧化还原梯度由更深的基底或相邻的沉积物中运输而来。

    到目前为止，IODP336航次是唯一专注于硬质岩石环境的微生物学研究。综合分子微生物，地球化学，矿物学，同位素和微观学的研究方法将应用于北池的研究。钻探结果和CORK系统将会为我们研究海底下的生物地球化学进程提供新的视野和长期的机会，当然这只针对年轻脊侧翼的部分，而这一部分很可能代表着全球“普遍的”脊侧翼进程。基底岩石和地壳流体的研究将会为我们了解海底下脊侧翼地壳中微生物的习性提供很好的平台，其中包括：海底下是否支持着一个独特的微生物群落？海底下脊侧翼生境中是否存在土著微生物？洋壳土著微生物与深部沉积物或深部海水中的微生物相比有何不同？这些微生物在生物介导的玄武岩氧化蚀变中发挥什么样的作用？地壳中微生物的代谢活性水平？通过对北池，一个可认为是普遍的、低温并且水文活跃的脊侧翼生境的代表，进行基底采样，展开系统的、综合的研究，这些问题将可能得到（或部分得到）解答。

    2. 航次执行情况

    IODP336航次于2011年9月16日从巴巴多斯的Bridgetown起航，同年11月16日在葡萄牙亚速尔群岛（Azores）靠岸,航行历时60天。根据航次计划，首先回收了已有钻孔395A中布放的温度和压力探头等装置，再向孔中放置新设计的包括了微生物矿物原位富集（FLOCS）等装置的CORK系统，但在放置CORK头部（wellhead）的时候，头部装置与井里的设备碰撞断掉。因此395A目前是敞开（原设计是密闭，去扰动），计划在2012年春季的后续航次看看能否用ROV把井里的设备回收。在395A附件钻了一个新井（U1383B），但后来因为钻井阻力过大而放弃。通过努力，成功在两个新钻的井（U1382A， U1383C）里放置了海底原位观测和试验的CORK系统。U1382A是一层设计（海底下90-210米），U1383C分为三层（上层海底下70-146米；中层海底下146-200米；底层海底下200-331.5米）。在开放大洋洋脊侧翼放置长期观测和实验的CORK装备，为研究洋壳中的深部生物圈和水圈相互作用和影响关系提供了机会。

    从U1382A， U1383C井里获取了岩石样本，岩石的柱回收率（core recovery）大约30%，这些岩石的处理和保存本着生物优先挑选的原则进行，尽可能在无菌条件下处理（如无菌消毒的盒子，锤子，无菌袋等等）。在航次结束前的约一周时间里，集中从位点U1382， U1383和U1384采集了4个沉积物柱，主要用于生物和化学分析。

    3. 航次后的研究工作

    本人航次后的工作计划主要分三个部分：（1）样品中生长缓慢的微生物的富集培养与分离；（2）利用微生物生态学方法，研究深部微生物的限度和性质，包括丰度、多样性和活性；（3）对感兴趣的微生物类群进行系统的研究，具体的工作由我们要回答的科学问题来确定，包括微生物与环境的相互作用、协同演化，环境中微生物参与下的碳、氮等元素的地球化学循环等。

    深部微生物的生长速率极低，所以需要合适的连续流培养系统。本实验室正在筹建高压连续流培养系统，同时以孔隙水化学性质可以作为特殊培养方法的参照，分别在有氧和厌氧条件下利用不同的电子供体和受体对微生物进行分离和富集。

    为了解深部微生物的限度和性质，我们需要获得其丰度、多样性和活性的信息。首先是活性，利用荧光显微镜镜，通过DAPI或SYBR Green染色，获得微生物的总量。古菌（ARCH915探针）、细菌（EUB338探针）和无细胞（NON338探针作为阴性对照）探针可对古菌和细菌的量分别计数，其结果可以与Q-PCR的结果相互验证。对于多样性的问题，还是以DNA为基础，高通量测序或构建宏基因组文库，展示原核生物的多样性概况。同时，本实验已成功建立针对深海样品的、有效的、系统的RNA提取和扩增方法。利用宏基因组和宏转录组的数据，比较不同位点的样品或相同位点不同深度的样品，揭示微生物群落的代谢和活性多样性，研究深部微生物的代谢基础，是否有一些类群存在不同的代谢途径及微生物的演化次序。

    海洋中99％以上的微生物尚不能够培养，而宏基因组技术又难以关联微生物种类和功能，对于感兴趣的类群，可以借助当前以FISH为基础的流式细胞分选和全基因组扩增技术，通过对深海未培养微生物单个细胞的基因组进行分析，认识未知微生物的生态功能和进化地位。从活性的角度讲，利用同位素标记的底物如乙酸，CO2，CH4，NH4Cl，NaNO3等富集微生物，然后利用Nano-SIMS和全基因组扩增技术研究微生物的代谢途径。